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色譜柱信息
為解決越來越多的強極性藥物和小生物分子的分離難題，成都摩爾科學公司開發了一系列弱酸性、中性和堿性HILIC（Hydrophilic Interaction Chromatography）固定相來分離具有強極性的堿性、中性和酸性化合物。該類固定相是以高純度具有良好機械穩定性的硅膠為基質，采用高純度的鍵合試劑，可******限度實現硅膠表面覆蓋，從而確保了固定相的穩定性。通過嚴格控制單分子層形成以及封尾的化學反應條件，可確保柱與柱之間有著******的重現性。該填料為均一的球形顆粒，孔徑120?，比表面積300m2/g。
圖1顯示的是HILIC固定相的化學結構，類型包括Polar-100、Polar-Diol、Polar-Silica、Polar-Pyridine和Polar-Imidazole。Polar-100和Polar-Diol是中性的極性固定相，后者的極性要高于前者。Polar-Silica是弱酸性固定相。Polar-Pyridine和Polar-Imidazole是堿性固定相，后者的堿性要強于前者。
圖1 HILIC鍵合相的化學結構
通過運用獨有的勻漿裝填技術裝填得到的HILIC柱柱床密度均一穩定，可******具有******的柱效。從而在極性和親水化合物如碳水化合物、代謝物、酸與堿、有機與無機離子、金屬復合物、氨基酸、多肽和蛋白水解物等的分離過程中，作為改變柱選擇性和提高柱分辨率的工具。右圖是對于4.6 x150 mm 的HILIC色譜柱的質量控制測試譜圖。
圖2 HILIC色譜柱的QC色譜圖
Column: Sepax HILIC, 4.6mm I.D.×150mm, 5μm
Mobile Phase: CH3CN: 10mM NH4Ac =90:10 (v/v)
Flow rate: 1.0mL/min
Detection: UV 254nm
Injection Volume: 1μL
Temperature: Ambient
Sample: 1.Uracil, 2. Adenosine, 3. Uridine, 4.Cytidine, 5.Guanosine
特性
? 獨特的化學健合技術使HILIC固定相的表面具有酸性、中性和堿性的性質
? 采用孔徑可控的超純硅膠
? 有1.8、2.2、3、5和10 μm等可選粒徑
? 高的化學穩定性，低固定相流失
? 有各種色譜柱規格：柱徑從75 μm到30，長度從 1到 30 cm
? 有克到千克級的填料
? pH穩定性: 1.5 - 8.0
? 適合分離極性藥物、多肽、氨基酸以及其它化合物等。
HILIC柱通常在高壓下運行。如果管路連接不緊，將會導致有機溶劑和注入樣品的泄漏，從而對操作人員的健康產生影響。一旦發生泄漏，應佩戴適當的手套進行處理。另外當打開色譜柱時還應采取適當的保護措施，以防止微小的硅膠顆粒進入呼吸道。
（a）******次使用的管線，請依次將管線接頭和密封卡套裝在外徑1/16”的管線上。密封卡套的寬口端應朝向管線接頭。
（b）將管線緊緊插入色譜柱的接口，向前滑動密封卡套和管線接頭，并使管線接頭的螺紋與色譜柱端口的螺紋相互銜接，然后擰緊管線接頭。如果管線為高分子材料，請轉到步驟（d）；如果是金屬管線，請繼續（c）。
（c）在用力將管線壓入柱端接口之后，用1/4”扳手將已擰緊的螺帽再進一步緊固。
（d）對色譜柱的另一端采用上述方法進行操作。
新的HILIC柱中的液相是含90 % (v/v)乙腈的醋酸銨(10mM, pH 6.8)溶液。在儲存和運輸過程中，硅膠填料可能會干涸。這時推薦用10-20倍柱體積的純有機溶劑如甲醇、乙腈等進行沖洗以活化色譜柱。接著可用用戶自己選擇的流動相沖洗色譜柱。流速由0.1 mL/min逐漸升至所需的操作條件，直至基線穩定為止。溶劑替換時請使用正常操作流速的一半。注：如果使用了含甲酸鹽的流動相（如甲酸銨、甲酸等）并把緩沖鹽沖洗掉后，在再次安裝色譜柱和使用含甲酸鹽流動相運行時需要稍長一些的時間進行平衡。注意溶劑組分的劇烈改變和頻繁的溶劑替換可能導致色譜柱壽命的縮短。
為了避免色譜柱的堵塞，所有樣品和溶劑，包括緩沖溶液在內，都必須在使用前用0.45 mm或0.2 mm的濾膜過濾。樣品溶劑需要含60-****有機溶劑或為初始洗脫液組成。水的比例應被***小化。******使用弱親水作用溶劑如乙腈。推薦使用5%的水作為自動進樣器的清洗液。用于HILIC的相對溶劑強度為：
丙酮<乙腈<異丙醇<乙醇<甲醇<水
適用于HILIC分離的緩沖鹽體系為甲酸鹽和醋酸鹽，因為它們在很高比例的有機溶劑中也有很好的溶解性。避免使用磷酸鹽以及其它低溶解性緩沖鹽，以防止在柱床產生沉淀。對于大多數分析樣品，推薦的緩沖鹽濃度為5-20 mM，根據在洗脫液中溶解度的不同，上限為200-300 mM。避免使用TFA和其它離子對試劑，因為它們會干擾HILIC分離機理，并抑制MS信號。
在通常的HILIC應用中，一般使用含50-95%濃度乙腈的水溶性緩沖鹽（如甲酸銨、醋酸銨或它們的酸，在有機相中具有很高的溶解性）。
如果對柱子并不熟悉，推薦的起始和平衡程序為從90% (v/v)乙腈/10 % (v/v) 緩沖液 (如10 mM醋酸銨)到40% (v/v) 乙腈的梯度。一開始請使用相對較低的流速以確保獲得******的分離效率。
流動相在使用前需要脫氣。一個簡單的脫氣方法是將流動相在由水泵形成的真空下超聲5min。
pH HILIC色譜柱可在pH 1.5 ~ 8范圍內操作，避免使用強堿和氫氧化鈉進行清洗。為了獲得******的分離效果和延長柱的使用壽命，請盡量使用pH在2 ~ 7.5范圍內的流動相。
壞色譜柱和輸液泵。由于壓力來源于流速，因此******流速將受制于系統所能承受的壓力。一般而言，柱壓會隨著色譜柱使用時間的增加而逐漸增加。
溫度 ******操作溫度為60 oC。長時間在高溫（>70 oC）下操作也會損壞色譜柱，這種情形在高的pH（>8.0）條件下特別突出。
儲藏 長期不用時，請將色譜柱保存在乙腈/水（95:5，v/v）中。為了防止柱床干涸，請用堵頭塞緊色譜柱的兩端。
清洗和再生 壓力突然增加預示色譜柱入口端的篩板發生了堵塞。在這種情況下，建議將色譜柱反接后用適宜的溶劑進行沖洗。 如果柱壓升高或選擇性發生變化，請使用乙腈/水（50 : 50，v/v）來清洗去除極性污染物。如果該沖洗程序并不能解決問題，則使用乙腈/水（95:5，v/v）進行清洗。
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